Cy系列荧光染料

Cy (Cyanine) 系列, 也叫菁染料,即花青素系列荧光染料是具有多聚次甲基桥链化学结构特点的一类合成荧光染料。Cy染料的次甲基桥链(1-7个次甲基)两端常常连着两个氮原子,其中一个氮原子带正电,从而Cy染料形成具有离域正电荷效应的介离子化合物。因为这个结构特点,Cy染料的消光系数(extinction coefficient)非常高。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值,从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。

广义的Cy染料是一种结构和应用非常广泛的一大类荧光化合物。在这里我们主要讨论用于生物标记的Cy染料,包括Cy3,Cy3.5,Cy5,Cy5.5,Cy7和Cy7.5。所有的这些染料都是上世纪70年从染料ICG(Indocyanine Green)衍生出来的,和ICG一样它们都有两个对称的indolenine发色团。这种构架让Cy染料的非特异性吸附少,消光系数高,荧光量子产率高,从而让标记显影时背景弱,信号强。细胞荧光标记中,它们常常取代荧光素(FITC,FAM) 和罗丹明 (TRITC, RRX)等荧光染料。除细胞显影外,它们也常用于生物筛选,蛋白免疫印迹,生物医学显影,小动物体内成像等。

Cy染料的亚甲基桥结构

荧探生工提供两种Cy系列荧光染料:普通Cy染料和磺化Cy染料(sulfo-Cy)。这两类染料有相同的骨架结构,所以它们具有几乎一样的荧光谱图和荧光灵敏度,在大多数情况下可以交换使用。仅有的不同是磺化Cy染料在其发色团上各有两个硫酸离子官能团,所以这类染料具有非常好的水溶性。在对样品水溶性(比如被标记物水溶性差希望标记后分子水溶性好)或者被标记生物分子稳定性(比如一些蛋白分子)要求较高时,磺化Cy染料是更好的选择。

普通Cy染料

这类染料包括Cy3,Cy3.5,Cy5,Cy5.5,Cy7和Cy7.5,其中Cy3, Cy5和Cy7的发色团是indolenine,而Cy3.5, Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole仅仅比indolenine多了个苯环,这多余的一个苯环让整个染料吸收峰和发射峰红移,从而让Cy染料系列覆盖更广泛的荧光谱图。Cy染料的结构几乎是对称的,为了让染料可标记,这其中的一个发色团上引伸出一个6碳链羧基来活化标记。

cy3 cy5 cy7 cy3.5 cy5.5 cy7.5

尽管带一个正电荷,普通Cy染料的水溶性比较低。在标记生物分子时(一般在缓冲溶液中),常常需要加入有机溶液(一般5-20%的DMF或者DMSO)助溶。常规操作是将染料先溶于有机溶剂中,然后按比例加入到生物分子的水溶液中反应。反应完成后离心除去沉淀的染料,再透稀或者除盐柱除去未反应的染料小分子。当然普通Cy染料也可以直接在有机溶剂中和标记其他有机小分子,Cy染料易溶于氯仿,甲醇,THF,乙腈等常规有机溶剂,非常适用有机合成反应。 在现行的Cy7和Cy7.5中,市场上一般会有两种不同的结构,不同点一般在次甲基桥链上:直链次甲基桥链或者环己烯加固的桥链。前者是一种比较原始的,直接从ICG染料继承的结构,后者是优化的结构。和前者相比,后者结构更稳定,荧光量子产率提高了~20%,从而显影更灵敏。另外一些文献报道居于直链次甲基桥链Cy7和Cy7.5在小动物体内有非特异性和毒性,而桥链加固后的染料要好很多。

所有的普通Cy染料有基本相同的斯托克位移(Stokes shift),大概15nm到20nm之间。这个位移足够大(其实比很多荧光染料的斯托克位移都大,比如BODIPY系列),绝大部分荧光仪器都可以将荧光信号从激发光中分辨出来。另外,溶剂和环境对普通Cy染料的荧光特性影响很小,让它们可以胜任很多条件下的显影任务,比如低pH溶液或者脂溶性环境等。

cy染料吸收与发射荧光光谱图

磺化Cy染料

这类Cy染料是在普通Cy染料的发色团上加入硫酸基团从而大大增加了染料的水溶性。这类染料的水溶性非常高, 在标记反应中不需要加入任何有机溶剂助溶,另外标记上去的染料分子由于水溶性好不会聚集,也不会影响被标记大分子稳定。这点非常重要,特别是当每个目标生物大分子上需要标记多个染料分子,或者目标生物大分子溶解度低,稳定性差时。 目前荧探生工可提供的磺化Cy染料包括sulfo-Cy3,sulfo-Cy3.5, sulfo-Cy5, sulfo-Cy5.5, sulfo-Cy7和sulfo-Cy7.5。

磺化Cy染料化学结构

磺化后,Cy染料的荧光谱图(包括激发峰和发射峰)发生了非常细小的蓝移,这是一个非常普遍的现象,比如Rhodamine 123 到Alexa Fluor® 488,这个蓝移非常小,蓝移后激发峰和发射峰仍在仪器的检测范围之内,所以不影响使用,也不必改设仪器参数。

Cy染料磺化引起光谱蓝移

普通Cy染料 vs 磺化Cy染料

尽管普通Cy和磺化-Cy在荧光光学性质上面近似,但它们在适用条件和标记方法上仍有所不同,值得注意。普通Cy染料水溶性低,必须预先溶解在有机溶剂(比如DMF或DMSO)中,然后加入到标记反应体系中,有机溶剂在有机/水混合溶剂中的含量需要达到10-15%(体积比率)才能保证染料不析出。相反,磺化-Cy染料在水中溶解性很好,可直接在水溶液中标记,因此特别适用于蛋白等对有机溶剂敏感的标记对象。如果希望反应后通过透析的方式纯化,务必使用磺化-Cy染料,磺化-Cy染料溶于水,多余的染料可以被透析出。如果通过离子交换树脂、电泳、凝胶过滤法纯化,普通Cy和磺化-Cy都适用。

普通Cy和磺化-Cy的适用条件分以下几种情况:

两种染料都适用:

· 较稳定的蛋白类,可承受少量有机溶剂长达数小时的

· 抗体(一般可承受5-10% of DMSO/DMF)

· DNA、RNA等核酸类

· 天然或者有机合成的高分子材料

· 多肽

· 可溶于DMF、DMSO、甲醇的小分子化合物

必须使用磺化-Cy染料:

· 敏感性蛋白,特别是有机溶剂会诱导变性的蛋白

· 需透析纯化的

· 对有机溶剂敏感的纳米材料

必须使用普通Cy染料:

· 必须在氯仿、乙醚等水不混溶型有机溶剂中标记的反应

· 标记后的产物希望仍然脂溶型或者希望其仍可透过细胞膜的探针

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